PCR反应中Hi-Di的作用是什么？
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  发布时间：2007-10-18 16:25:33

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PCR产物测序标准实验流程


BigDye Terminator v1.1试剂盒 休 闲 居 编 辑



BigDye Terminator v1.1专为PCR产物测序而优化。试剂取出融化后，先短暂振荡混匀，离心。操作在冰上进行。



1．对PCR产物的要求

纯度：OD260 / OD280 = 1.6 ~ 2.0，用量：每反应10 ~ 100 ng。强烈建议在测序前，先纯化PCR产物。方法如下：

1. 每20 μL PCR产物中加入2 μL 3M NaAc、50 μL 100%酒精。
2. 台式离心机12000 x g 4°C离心30 min，马上用枪吸尽上清液。
3. 加入70 μL 70% 酒精，12000 x g 4°C离心15 min，马上用枪吸尽上清液。
4. 让酒精在室温挥发干净，加入10 μL 去离子水溶解DNA。





2．PCR产物的测序PCR反应

标准反应体系：

试 剂 用 量

纯化的PCR产物 (10 ng / μL) 1 μL

BigDye (2.5 x) 8 μL

引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL

灭菌去离子水 10 μL

总体积 20 μL

1/2反应体系：

试 剂 用 量

纯化的PCR产物 (10 ng / μL) 1 μL

BigDye (2.5 x) 4 μL

BigDye Seq Buffer (5 x) 2 μL

引物 (3.2 pmol / μL) 1 μL

灭菌去离子水 12 μL

总体积 20 μL

96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25个循环 → 4 °C保温



3．测序产物纯化

96孔板整板离心方法：

1. 每孔依次加入2μL 125mM EDTA和2μL 3M NaAc到溶液中，再加入50μL 100%酒精，盖好，震荡4次，室温15 min。
2. 板式离心机3000 x g 4°C离心30 min；马上倒置96孔板，离心至185 x g 立即关闭离心机电源，停止离心。
3. 加70μL 70% 酒精，3000 x g 4°C离心15 min；马上倒置96孔板，离心至185xg 关闭离心机电源。此步可以重复1次。
4. 让酒精在室温挥发干净，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机电泳。


单个0.2 mL离心管离心方法：

1. 每孔依次加入2μL 125mM EDTA和2μL 3M NaAc到溶液中，再加入50μL 100%酒精，盖好，震荡4次，室温15 min。
2. 台式离心机12000 x g 4°C离心30 min，马上用枪吸尽上清液。
3. 每孔加入70 μL 70% 酒精，12000 x g 4°C离心15 min，马上用枪吸尽上清液。此步可以重复1次。
4. 让酒精在室温挥发干净，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机电泳。





4. 部分相关试剂

125 mM EDTA：按《分子克隆》配制。

3M NaAc：取102.06 g NaAc·3H2O，溶于200 mL dH2O中，用冰醋酸调pH至5.2，定容至250 mL，分装，高压灭菌，
室温保存。注 意：BDT v1.0、v2.0 和 v3.0 使用的NaAc pH 是4.6，v1.1 和 v3.1使用的NaAc pH是5.2。

酒精：100%酒精使用国产分析纯；70%酒精用去离子水配制。

BigDye Terminator v1.1 / v3.1 Sequencing Buffer (5x)：4336697，1 mL；4336699，28 mL；4336701，233 mL。

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